近年来，液体活检因其侵入性小和能够实现频繁或连续采样而备受关注，尤其是在肿瘤进展和治疗反应监测中表现出色。其中，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）作为一种由细胞释放的膜结构，含有多种生物分子，如脂质、蛋白质和RNA，因其能够真实反映活体细胞的状态，越来越多地被应用于生物标志物的研究。

研究表明，EV小RNA生物标志物的诊断性能通常优于单一生物标志物，且EV小RNA在血浆中的诊断价值优于血清。通过对前列腺癌患者的尿液小RNA表达分析，有研究发现十种尿液小RNA可作为前列腺癌早期诊断工具。此外，有研究者指出，血液来源的EV中的长链RNA表达谱可以作为胰腺导管腺癌的生物标志物，能够有效区分健康个体与恶性肿瘤患者。

传统的cfRNA研究通常采用短读长测序方法，但这种方法在解析全长转录本异构体和复杂RNA加工事件方面能力有限。相对而言，cfRNA中的细胞外囊泡RNA完整性更高、长度更长，采用长读长RNA测序技术可以对EV RNA的全长转录本进行直接测序，进而发现更多新型RNA异构体，提升其在临床应用中的价值。

来自尊龙凯时的研究团队意识到长读长测序的优势，聚焦于利用此技术进行血液EV RNA检测，以验证EV RNA在疾病诊断中的关键作用。该团队发现，现有基于DNA的方法可能错失癌症的早期阶段，而早期诊断能够促使早期治疗，降低死亡率。通过COMPLETE-seq RNA流程，他们基于高特异性的膜亲和技术和硅胶膜柱法进行血浆EV RNA提取，结合纳米孔长读长技术和短读长技术进行测序，从而获取EV RNA转录组的全面信息。

研究结果显示，血液中存在大量来自重复序列的游离RNA，可以作为疾病特异性诊断生物标志物，相关研究成果已发表在《Nature Biomedical Engineering》期刊上。该研究利用COMPLETE-seq RNA流程，从血浆中提取EV RNA，反转录为cDNA并进行文库制备，随后进行短读长测序和长读长测序的对比分析。

长读长RNA测序结果表明，几乎所有胰腺癌患者的样本中均发现大量的游离RNA，特别是SINE元件的RNA。通过与癌症基因组图谱计划（TCGA）和GTEX联盟中的正常样本对比，研究团队发现“数百个重复衍生的转录本在食道癌中大量且特异性富集”，进一步确认了重复RNA序列作为潜在疾病特异性生物标志物的价值。

虽然研究表明，血浆中的cfRNA常常为短而碎片化的状态，但该团队的全长cDNA纳米孔测序提供了不同的结论，数据显示mRNA可达1,337 nt，lncRNA为970 nt，其他RNA的长度也显著高于传统认识。这一发现表明，纳米孔长读长测序揭示了全长、带帽子RNA分子的存在，且部分RNA长度可达1 kb。

在该项研究中，首先从健康对照和胰腺癌患者的血液样本中分离出血浆，随后使用exoRNeasy（QIAGEN）试剂盒对过滤后的血浆进行处理，分离EV RNA，并进行cfRNA的长读长和短读长测序。结果显示，经过exoRNeasy试剂盒提取得到的EV RNA完整性很高，未发生降解。

对于细胞外囊泡RNA的快速高效分离，exoRNeasy系列试剂盒能够支持对多种大体积样本的处理。在完成EV的特异性分离后，可直接在柱上完成裂解，结合QIAGEN经典的硅胶膜技术高效提取总RNA，适用于下游各种小RNA的检测与分析。如果仅需分离EV，exoEasy Maxi Kit亦可以实现快速分离，无需超速离心或沉淀，25分钟即可完成。

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